染料法（如SYBR Green I）的工作原理是基于“通用型”的熒光染料能與任意雙鏈DNA結合。在PCR擴增過程中，染料會嵌入所有新合成的雙鏈產物中，從而產生熒光信號。這意味著，只要有雙鏈DNA被擴增，無論它是目標產物還是非特異的引物二聚體或錯配產物，都會被記錄下來。對于長度僅22nt左右的miRNA，其反轉錄和擴增引物設計本就復雜，極易形成引物二聚體，導致染料法產生“假陽性”信號，使得定量結果虛高，干擾對藥物療效或基因表達的真實判斷。

而探針法（如TaqMan探針法）則從原理上規避了這一風險。如相關服務中所概述的“基于探針的化學法”，它在反應體系中引入了一條特異的熒光標記探針。這條探針是一段能與目標miRNA序列中部特異性結合的寡核苷酸，兩端分別標記了熒光報告基團和淬滅基團。當探針完整時，熒光信號被淬滅。只有在PCR擴增過程中，當Taq酶的5'→3'外切酶活性遇到結合在模板上的探針時，會將其切割，使報告基團與淬滅基團分離，從而發出熒光。

這一機制決定了探針法具有雙重特異性：信號不僅來自于引物的正確擴增，更來自于探針與目標序列的成功雜交。只有當引物和探針都與目標miRNA匹配時，才能檢測到熒光累積。這相當于為定量反應加裝了一道“雙重驗證”的門禁，有效過濾了由引物二聚體或其他非特異性擴增產生的噪音。

因此，在那些對數據準確性要求高的場景中——例如區分序列高度同源的miRNA家族成員、在珍貴臨床樣本中進行絕對定量分析，或是需要建立嚴格量效關系的藥物療效考核中——探針法憑借其良好的特異性，成為規避干擾、還原真實表達水平的更優選擇。盡管成本相對較高，但它所提供的確定性，為后續的生物學解讀和臨床決策構筑了堅實可靠的基礎。

 

miRNA熒光定量檢測服務

產品介紹

Real Time PCR，即實時熒光定量PCR，也被稱為定量PCR或qPCR，是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法

由于定量PCR具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等優點，被廣泛應用于醫學檢測、藥物療效考核、基因表達研究、轉基因研究、基因檢測、病原體檢測、動植物檢測、食品檢測等各種領域

實驗原理

所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法

實時熒光定量PCR技術類型概述: DNA結合染料法, 基于探針的化學法, 猝滅染料引物法

實驗應用

DNA及RNA定量；基因表達驗證；等位基因鑒別；SNP分型；病原體和病毒檢測；多重PCR

實驗結果